作为一种新兴的生物偶联治疗药物，AOC由抗体、连接子和高电荷核酸载荷组成，将单克隆抗体的靶向特异性与寡核苷酸载荷的基因调控功能相结合。由于AOC具有复杂性和异质性，因此需要采用正交分析策略进行全面表征。传统上，通常需要在不同质谱平台上开展多种分析方法，才能完成这一具有挑战性的分子类型的完整表征。本研究建立了一套多层级AOC表征工作流程（图1），该流程在同一质谱平台上整合了多种互补的LC-MS分析方法，可从完整蛋白或核酸分子、蛋白亚基及肽段等不同结构层级全面解析AOC。
图1. 使用互补的LC-MS工作流程进行AOC的全面表征。借助ZenoTOF 8600系统进行色谱分离及LC-MS数据采集，并使用 SCIEX OS软件和 Biologics Explorer 软件进行自动化数据分析，从而简化AOC表征流程。出于保密目的，mAb序列已进行遮蔽处理。
方法
样品制备：
AOC、mAb和siRNA样品由石药集团核酸药物研究院提供。 色谱条件： AOC和mAb的Native SEC-MS分析在ExionLC AE系统 (SCIEX)上进行，使用 Phenomenex Biozen dSEC-2色谱柱(150 × 4.6 mm, 1.8 μm)，肽图分析使用肽图色谱柱 (150 × 2.1 mm, 1.7 μm)。 质谱条件： MS数据在ZenoTOF 8600系统 (SCIEX)上采集。Native SEC-MS和肽图数据采用正离子模式采集，而siRNA的IP-RP LC-MS分析采用负离子模式进行。 结果与讨论 1. 半胱氨酸偶联的mAb-siRNA AOC 本研究分析用的AOC样品是通过将含马来酰亚胺连接子的siRNA与mAb上的半胱氨酸残基偶联合成的（图2）。通过部分还原mAb重链和轻链（HC和LC）之间的链间二硫键，产生可反应的巯基；随后这些巯基与正义链寡核苷酸（Sense oligonucleotide, SO）上带有马来酰亚胺连接子的siRNA载荷发生偶联。 图2. AOC合成示意图。HC和LC之间链间二硫键的部分还原暴露出游离巯基，随后这些巯基与siRNA-linker偶联生成AOC。 2. Native SEC-MS分析 半胱氨酸连接的AOC分子中包含非共价相互作用，而这些相互作用在传统RPLC-MS工作流程所采用的变性条件下会被破坏，因此本研究采用native SEC-MS 作为AOC完整分子量表征路线。SEC在较温和条件下对不同尺寸/形态组分进行分离，同时挥发性缓冲盐体系可与高分辨质谱兼容，从而支持完整AOC的分子量解析与偶联形态归属。 图3展示了mAb和AOC样品在Native SEC-MS条件下分析得到的热图和解卷积谱图谱。Biologics Explorer中的热图能够清晰呈现未偶联mAb（图3A）和 AOC（图3C）的Native SEC-MS数据。与未偶联mAb相比，AOC的离子图显示出可归属于OAR0、OAR1和OAR2的不同载荷分布。mAb数据的解卷积结果（图3B）显示主要糖型分布，而AOC数据的解卷积结果（图3D）确认存在多个具有不同OAR值的物种。基于这些OAR载荷的相对丰度，软件自动求算出该AOC样品的平均OAR为1.02。 图3. mAb和AOC样品的Native SEC-MS分析。Biologics Explorer生成的热图可清晰显示未偶联mAb（A）和AOC（C）的Native SEC-MS数据。与mAb相比，AOC热图显示了对应于OAR0、OAR1和OAR2的多个物种分布。mAb数据的解卷积结果（B）突出了主要糖型分布，而AOC数据的解卷积结果（D）确认存在具有不同OAR的物种，该AOC的平均OAR为1.02。 3. 肽图分析 抗体序列确认和翻译后修饰(PTMs)表征对于理解AOC的整体质量非常重要5。本研究采用肽图分析对AOC中的抗体部分进行全面表征。 采用EAD DDA采集模式，仅需一次进样即可获得接近完整的序列覆盖率。其中重链（HC）和轻链（LC）的序列覆盖率分别达到98.4%和98.6%（图1）。采用 CID DDA 模式也获得了相似的序列覆盖率（数据未显示）。 与传统碰撞诱导解离（CID）等基于碰撞的MS/MS技术相比，EAD 作为电子活化碎裂方式，能保留某些易丢失修饰、增强修饰位点判定，在表征不稳定翻译后修饰（PTM）、二硫键连接以及氨基酸异构体等方面具有独特优势3,4。为展示EAD在PTM表征中的应用价值，本研究选取了具有代表性的PTM肽段进行分析。 图4以含G0F的糖肽EEQYNSTYR为例，展示了CID和EAD两种碎裂模式的质谱结果。CID分析过程中，易裂解的糖链优先发生断裂，在低m/z区域产生丰富的氧鎓离子（例如m/z 138和204），同时生成不带糖链的碎片离子（图 4A）。相比之下，EAD可在相应的c型和z型碎片离子上保留G0F糖链，从而实现可靠的肽序列确认和糖链定位（图4B）。 EAD还能够产生具有诊断意义的碎片离子，用于氨基酸异构体的准确区分。图5展示了VVSVLTVLHQDWLNGK（VVSV）肽段中Asp和isoAsp异构体的分离检测及EAD鉴定结果。EAD谱图中检测到z3+1−57碎片，确认40.8 min的峰对应isoAsp形式（图5B）。相比之下，41.1 min未检测到z3+1−57离子，而是检测到z3+1−44碎片，表明该峰对应Asp异构体（图5C）。结果表明，EAD能够通过诊断性碎片离子的差异实现Asp和isoAsp异构体的可靠区分。 图4. N-糖肽分析。（A）CID优先裂解糖肽EEQYNSTYR上的G0F糖链，在低m/z区域产生丰富的氧鎓离子，并产生不带糖链的序列离子。（B）EAD生成一系列带有或不带有G0F的c型和z型碎片离子，从而实现糖链的准确定位。 图5. AOC样品中VVSV肽段Asp/isoAsp异构体的区分。在VVSV肽段的提取离子图（XIC）中检测到两个异构体峰（A）。EAD产生的特征性碎片离子z − 57 ，可用于区分isoAsp（B）和Asp（C）异构体。 4. siRNA标准品分子量确认 为了对AOC样品中核酸载荷的解释提供正交支持证据，本文进一步采用寡核苷酸色谱柱联用IP-RP-LC-MS负离子模式对siRNA标准品进行了单独分析。在本研究所用色谱条件下，双链siRNA解离为反义寡核苷酸链（Antisense Oligonucleotide, ASO）和正义链（SO），从而实现两条链的精确分子量测定。图6A中的TIC图显示，两条链实现了清晰的色谱分离，表明该IP-RP条件能够有效分离变性后的siRNA组分。 相应的，结合对应的离子图和解卷积后的分子量结果，可对两条链进行明确归属。图6B–6C和图6D–6E分别展示了ASO和SO的离子图及完整分子量确认结果。在两种情况下，均对观察到的电荷态分布进行了解卷积，以生成链特异性的分子量，从而为siRNA组分的身份确认提供直接证据。总体而言，这些结果在链水平确认了siRNA标准品的分子量，并为AOC样品中寡核苷酸载荷的解析提供了支持性证据。 图6. siRNA标准品的IP-RP LC-MS分析结果。（A）中的TIC显示siRNA双链中的ASO和SO实现了基线分离。（B–C）和（D–E）分别显示ASO和SO的电荷分布及解卷积后的分子量结果，从而支持siRNA标准品在链水平上的分子量确认。 结论 本研究建立了结合ZenoTOF 8600系统与Biologics Explorer软件优势的多层级表征工作流程，实现了对mAb-siRNA AOC及其组成部分的全面表征。 Native SEC-MS可直接检测完整AOC组分，并通过OAR测定快速评估偶联效率。 基于EAD的肽图分析实现了抗体部分的高序列覆盖率，能够准确定位不稳定PTM，并有效区分肽段异构体。 IP-RP LC-MS分析确认了siRNA标准品的完整分子量，为AOC表征提供了正交验证。 上述正交分析流程实现了从色谱分离、方法建立和数据采集到结果解析的高效衔接，为AOC的全面表征提供了便捷且可靠的分析方案。 ZenoTOF 8600系统在AOC表征中的优势 高灵敏度： 系统配备Zeno Trap功能，可为Native SEC-MS和基于EAD的肽图分析提供高灵敏度的MS和MS/MS结果。 灵活性： 该系统支持在正离子和负离子模式下采用CID或EAD进行数据依赖采集（DDA）。 EAD优势： EAD可提供信息丰富的MS/MS数据，用于不稳定PTM的位点及异构体分析。 简化工作流程： Native SEC-MS、肽图分析和IP-RP LC-MS等工作流程可实现AOC的全面表征，覆盖从色谱分离、基于DDA（数据依赖采集）的数据采集，到自动化数据分析的完整流程。
冀公网安备13110802000160号
